一、药典法无菌检测

2020年版中国药典三部中无菌检查法（通则1101）中，药典无菌检测的方法分为薄膜过滤法和直接接种法。

薄膜过滤法：将规定量的供试品或供试液通过薄膜过滤处理，使产品中可能存在的微生物过滤时被阻留、富集在微孔滤膜上，然后接种适宜的培养基，使滤膜上阻留的微生物得以生长繁殖到肉眼能观察到的状态而被检出，有抑菌性的供试品通过薄膜过滤后，用适当的冲洗液冲洗滤膜、滤器充分消除残留的抑菌成分，使滤膜上阻留的微生物得以生长繁殖到肉眼能观察到的状态而被检出，需采用封闭式薄膜过滤器，根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质，滤膜孔径不应大于0.45um，若使用其他尺寸的滤膜，应对稀释液和冲洗液体积进行调整，并重新验证。

直接接种法：直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中，对混悬液等非澄清水溶性液体供试品、固体供试品、非水溶性供试品、敷料供试品等供试品、灭菌医用器械供试品、放射性药品等多种特性供试品进行无菌检查。除生物制品外，一般样品无菌检查时两种培养基接种的瓶或支数相等；生物制品无菌检查时硫乙醇盐酸流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的瓶或支数为2：1，除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇盐酸流体培养基每管装量不少于15mL，胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10mL。

二、快速法微生物检测

随着新型生物制品的涌出，细胞治疗药物相继获批上市，细胞和基因治疗行业正快速蓬勃发展，细胞药物在研发和产业化过程中对无菌检查提出了新要求。传统培养方法主要表现为在时效性上无法满足这些生物制品的放行检需求，传统培养方法至少需要14天的培养时间才可以出结果，且细胞类制品样品量少，使传统无菌试验检测污染物的能力受到限制。因此，各国陆续建议研发和推广采用经过验证的快检方法——快速法微生物检测替代传统无菌培养法检查。

无菌检查快速检测法包含ATP 生物发光检测法、微热量计法、CO₂检测法、电阻抗检测法、流式细胞技术、核酸扩增技术等。

CO₂检测法：通过监测密闭容器CO₂含量的变化可以监测微生物的代谢和生长。若检测样品中有微生物存在，微生物代谢产生CO₂，CO₂信号被感应器捕获并处理，判定样品为阳性。若检测样品中没有微生物存在，在适当条件下经过一定天数培养后，CO₂水平不会发生显著改变，则判定样品为阴性。

核酸扩增技术：实时荧光定量 PCR是在传统PCR基础上加入荧光信号系统从而达到实时监测PCR扩增的目的。根据细菌的16S rRNA基因保守序列，选择通用引物和特异性荧光探针，利用qPCR方法和现行药典方法对样品进行无菌检查，此外，使用叠氮溴化丙锭(PMA)可有效去除样品中死菌和其DNA片段的干扰，或通过离心/洗涤步骤从检测样品中除去游离的微生物DNA并且分析细菌沉淀，确保实时荧光定量PCR方法能准确区分出样品中活菌的存在。

流式细胞技术：流式细胞术是采用流式细胞仪对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的一项技术手段。我们可以通过选用适当的荧光物质对样品中微生物进行荧光标记，标记后的微生物细胞以单细胞的形式通过流式细胞柱，受特定波长的光激发，产生荧光信号，荧光信号由灵敏的检测器收集并由数字处理器分析，从而实现对样品中微生物的检测分析。

流式细胞术可被用于在24-48小时的富集培养步骤后检测荧光标记的活微生物细胞。由荧光底物或活体染色剂组成的标记试剂被用于区分活细胞与死细胞和细胞碎片。虽然细菌非常小并且可能难以与细胞碎片区分，但它们可以通过大小、形状和荧光强度来区分。细胞活力表现为完整细胞膜保留由非特异性细胞酯酶产生的荧光色素的能力，或用核酸特异性活体染色标记细胞的能力。激光照射流体介质中的每个细胞，并通过双光电倍增管阵列检测发射的光。信号由鉴别软件数字化和解释。

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