干细胞制剂的质量检验-支原体检测

支原体是细胞外生存的最小微生物，大小为0.1～0.3微米，介于细菌和病毒之间，是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。种类繁多，分布广泛，造成的危害相当大，涉及人、动物、植物及昆虫等多个领域，给人类健康和科研工作带来不利影响。从人体分离的16种支原体中，主要有4种对人有致病性，即肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体。

人工培养支原体营养要求比一般细菌高，除基础营养物质外还需加入10～20%人或动物血清以提供支原体所需的胆固醇。最适pH 7.8～8.0之间，低于7.0则死亡，但解脲脲原体最适pH 6.0～6.5，大多数兼性厌氧，有些菌株在初分离时加入5% CO₂生长更好。生长缓慢，在琼脂含量较少的固体培养基上孵育2～3天出现典型的“荷包蛋样”菌落：圆形（直径10～16um），核心部分较厚，向下长入培养基，周边为一层薄的透明颗粒区。此外，支原体还能在鸡胚绒毛尿囊膜或培养细胞中生长，繁殖方式多样，主要为二分裂繁殖，还有断裂、分枝、出芽等方式。

支原体因为个头小，能穿过0.22 um滤器，并且在实验室内会潜在的扩散。支原体污染细胞后，培养液不一定会发生混浊。多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。所以支原体感染会使培养的细胞慢慢枯萎，使得用被污染的细胞样本做的实验完全失去意义和价值。因此，有必要对新引进的细胞和实验过程中的细胞株进行支原体检测。

药典法支原体检测

《中国药典2020年版 3301支原体检测法》中指出：主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检测时，应同时进行培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）。

培养法：接种待检样品于固体培养基或液体培养基，在一定条件下培养，如有支原体，固体培养基上可观察到“荷包蛋”状支原体菌落，液体培养基则会因为支原体数量达到一定程度影响pH值而与指示剂产生颜色反应而被检出。固体培养法是最原始的方法，简单直观，缺点是后来发现有很多支原体难以在固体培养基上形成菌落，容易造成假阴性结果；液体培养基则能弥补固体培养基的缺陷，但是检测经常受到指示剂加入量、变色范围较小等因素的干扰。因此液体培养法和固体培养法通常一起使用，使检测结果更加可靠。培养法的检测周期较长，一般在28天左右，不能快速检出。

指示细胞培养法（DNA染色法）：将待检样本接种于指示细胞（无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞）中培养后，用特异荧光染料（如Hoechst染料）染色。支原体污染，会在细胞表面或者培养基中见到大小不等、不规则的荧光着色颗粒，与细胞核呈现的椭圆形、更大更亮荧光形成鲜明对比。

与支原体培养法相比，突出优点是结果简单直观，可以检测到不易培养支原体，例如M. hyorhinis，约7-14天可得到结果。缺点有假阳性、假阴性的可能，比如在细胞粘附性比较差的支原体（精氨酸类支原体），染色法的检出效果较差；支原体污染不严重时容易得到模棱两可的结果，只有在污染严重时才能得到可信度高的结果。

分子生物学方法

巢式PCR法：是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR法降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性，使用两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性，巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有第一对引物，降低引物非特异性扩增的污染。

支原体的rRNA是进化上较为保守的大分子，与细菌的差异较明显，以支原体的核糖体16s至23s rRNA序列作为目的片段设计通用引物，可以检测出大部分支原体。再利用巢式PCR法进一步排除非特异性扩增，增强检测结果的可靠性。

qPCR法：利用聚合酶的 5´→3´ 核酸外切酶活性，将淬灭的目标特异性探针切断发出荧光，并实时监测荧光值的增加，以测量每个循环中的 DNA 扩增。在荧光信号显著超过背景荧光的位置，可以确定循环数或 Cq 值。Cq 值可用于评估两个或多个样品的靶基因相对丰度，通过已知稀释浓度样品的标准曲线，可对靶基因进行绝对定量。通过扩增高度保守的rRNA操纵子，或者更准确地说，扩增支原体基因组中的16S rRNA编码区，可以特异性地检测支原体。在520nm（FAMTM通道）检测支原体特异性扩增片段。

相较于巢式PCR法，qPCR法最低的稳定检测至10拷贝的支原体DNA，全程闭管操作，无产物交叉污染，通过内参扩增效率的检测，可有效检测试剂盒质量，样本中各类PCR抑制剂的影响，避免假阴性，操作简单，无需后期跑电泳步骤，通过CT值判断，可进行定量检测。结果可分为：阴性、弱阳性、阳性、强阳性，给科研人员提供更多的有用信息。

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